Bei dem Versuch F-14 wird der ATP-Gehalt von HeLa-Zellen mittels Lumineszenz-Assay bestimmt. Dazu wird zunächst eine ATP-Standarisierungskurve angelegt, damit in der Auswertung die Menge ATP in den Zellen bestimmt werden kann. Dazu wird eine Konzentrationsreihe an ATP erstellt. Im nächsten Schritt wird das Zellysat hergestellt, in dem der ATP-Gehalt bestimmt werden soll. Dazu werden die Zellen zentrifugiert und in Schwellpuffer resuspendiert. Nach weiterer Zentrifugation und Abdekantieren erfolgt ein mechanischer Aufschluss der Zellen im Douncer. Im letzten Schritt werden die Zellkerne und Zelltrümmer mittels Zentrifugation getrennt. Weiterhin wird die Kinetik des ATP-Abbaus in dem Zellysat ermittelt. Dazu wurde das Zellysat zunächst inkubiert und anschließend ein Aliquot der Probe in unterschiedlichen Zeitetappen mit Kochpuffer versetzt und weitere fünf Minuten bei 95 °C inkubiert, um den Abbau des ATPs im Zellysat zu stoppen. Nach einer Zentrifugation wird der Überstand zur Messung abgenommen.
Im weiteren Verlauf des Versuches erfolgt eine Standardisierung der Proteinmenge mittels Bradford-Assay. Da für den Aufschluss der HeLa-Zellen Douncer verwendet werden, muss eine Standardisierung erfolgen. Die Douncer „haben leicht unterschiedliche Maße, sodass der Prozentsatz an aufgeschlossenen Zellen je nach verwendetem Douncer variiert“(Skript). Durch die Äquivalenz ergibt sich dann auch, dass das hergestellte Zellysat unterschiedliche Mengen an Protein enthält und dementsprechend auch an ATP. Damit ein Vergleich möglich ist, muss die Menge an detektiertem ATP in einem Bezug zur Menge an Proteinen im Zellysat stehen. Der Zusammenhang wird durch das Bradford-Assay gewährleistet, womit dann auch die Proteinmenge bestimmt werden kann. Zunächst wird eine Standardisierungskurve des Bradford-Assays erstellt. Dazu wird eine lineare Verdünnungsreihe des Proteins BSA angelegt und die OD bei 595 nm bestimmt.
Im letzten Schritt des Versuchs wird die Kinetik des ATP-Abbaus mittels Luciferase-Assays analysiert. Dazu werden die zuvor angefertigten ATP-Lösungen und die Proben des denaturierten Zellysates in eine Mikrotiterplatte vorgelegt und jeweils mit dem Luciferin/Luciferase-Reagenz versetzt. Die Auswertung erfolgt über den Luminometer.
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
2 Durchführung
3 Auswertung
4 Diskussion
5 Literaturverzeichnis
1 Einleitung
Bei dem Versuch F-14 wird der ATP-Gehalt von HeLa-Zellen mittels Lumineszenz-Assay bestimmt. Dazu wird zunächst eine ATP- Standarisierungskurve angelegt, damit in der Auswertung die Menge ATP in den Zellen bestimmt werden kann. Dazu wird eine Konzentrationsreihe an ATP erstellt. Im nächsten Schritt wird das Zellysat hergestellt, in dem der ATP-Gehalt bestimmt werden soll. Dazu werden die Zellen zentrifugiert und in Schwellpuffer resuspendiert. Nach weiterer Zentrifugation und Abdekantieren erfolgt ein mechanischer Aufschluss der Zellen im Douncer. Im letzten Schritt werden die Zellkerne und Zelltrümmer mittels Zentrifugation getrennt. Weiter- hin wird die Kinetik des ATP-Abbaus in dem Zellysat ermittelt. Dazu wurde das Zellysat zunächst inkubiert und anschließend ein Aliquot der Probe in un- terschiedlichen Zeitetappen mit Kochpuffer1 versetzt und weitere fünf Minuten bei 95 °C inkubiert, um den Abbau des ATPs im Zellysat zu stoppen. Nach einer Zentrifugation wird der Überstand zur Messung abgenommen.
Im weiteren Verlauf des Versuches erfolgt eine Standardisierung der Proteinmenge mittels Bradford-Assay. Da für den Aufschluss der HeLa-Zellen Douncer verwendet werden, muss eine Standardisierung erfolgen. Die Douncer „haben leicht unterschiedliche Maße, sodass der Prozentsatz an aufgeschlosse- nen Zellen je nach verwendetem Douncer variiert“(Skript). Durch die Äquiva- lenz ergibt sich dann auch, dass das hergestellte Zellysat unterschiedliche Mengen an Protein enthält und dementsprechend auch an ATP. Damit ein Ver- gleich möglich ist, muss die Menge an detektiertem ATP in einem Bezug zur Menge an Proteinen im Zellysat stehen. Der Zusammenhang wird durch das Bradford-Assay gewährleistet, womit dann auch die Proteinmenge bestimmt werden kann. Zunächst wird eine Standardisierungskurve des Bradford-Assays erstellt. Dazu wird eine lineare Verdünnungsreihe des Proteins BSA angelegt und die OD bei 595 nm bestimmt.
Im letzten Schritt des Versuchs wird die Kinetik des ATP-Abbaus mittels Luciferase-Assays analysiert. Dazu werden die zuvor angefertigten ATPLösungen und die Proben des denaturierten Zellysates in eine Mikrotiterplatte vorgelegt und jeweils mit dem Luciferin/Luciferase-Reagenz versetzt. Die Auswertung erfolgt über den Luminometer.
2 Durchführung
In der tatsächlichen Durchführung wurde zunächst eine Konzentrations- reihe an ATP erstellt. Dazu wurden Proben mit Konzentrationen von 10-3 M bis 10-10 M ATP erstellt. Dazu wurden 18 μl der Stammlösung mit einer Kon- zentration von 16,5 mM und 282 μl Wasser vermischt (Konzentration von 10-3 M). Für die je weitere Verdünnung wurden 30 μl aus der vorherigen Ver- dünnung entnommen und mit 270 μl Wasser versetzt. Dieser Vorgang wurde so oft wiederholt bis eine Verdünnungsreihe mit acht Proben entstanden ist. Die Proben wurden auf Eis gelagert.
In einem zweiten Schritt wurden die HeLa-Zellen für fünf Minuten bei 2000 rpm zentrifgiert und das überstehende Medium abdekantiert. Anschlie- ßend wurde der Schwellpuffer verdünnt, indem 1 μl 10 x Lysepuffer2 mit 9 μl Wasser versetzt wurden, wodurch ein 1 x Schwellpuffer entstand. Die Zellen wurden in 1 ml des Schwellpuffers resuspendiert und erneut fünf Minuten bei 2000 rpm zentrifugiert. Anschließend wurde das überstehende Medium abdekantiert und die Zellen in 1,2 ml Schwellpuffer resuspendiert und in einen Douncer überführt, welcher durch einen mechanischen Aufschluss die cytoplasmatischen Proteine frei werden lässt. Die Zellen wurden zehn Minuten im Douncer auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mechanisch aufgeschlossen (20mal). Das Homogenisat wurde dann zur Auftrennung der Zellkerne und Zelltrümmer vom Zellysat fünf Minuten bei 13000 rpm zentrifu- giert und anschließend in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Daraus wurden 100 μl für die Bradford-Messung entnommen und die restlichen 900 μl für die Kinetik-Bestimmung verwendet.
Für die Kinetik-Bestimmung wurde das gesamte Zellysat zunächst zwei Minuten bei 37 °C inkubiert. Nach den zwei Minuten wurden 100 μl entnom- men, mit 400 μl Kochpuffer versetzt und fünf Minuten bei 95 °C inkubiert (Wert 0), Nach sieben Minuten (Messung fortlaufend von Beginn an) wurden erneut 100 μl Zellysat entnommen, mit 400 μl Kochpuffer versetzt und weitere fünf Minuten bei 95 °C inkubiert (Wert 5). Für die Werte 10, 15 und 20 wurde je weitere fünf Minuten gewartet bei der Inkubation mit 37 °C. Durch das Ko- chen wurden die Proteine zerstört und der ATP-Umsatz gestoppt. Die denatu- rierten Proteine wurden durch eine zweiminütige Zentrifugation bei 13000 rpm sedimentiert. Der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überfuhrt und auf Eis gelagert.
Für die Standardisierung der Proteinmenge mittels Bradford-Assay wurde zunächst eine Standardisierungskurve des Bradford-Assays erstellt. Da- zu wurde eine lineare Verdünnungsreihe des Proteins BSA von 0 μg bis 14 μg erstellt. Die verwendete Stammlösung hatte eine Konzentration von [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten]und wurde auf [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten]verdünnt (10 μl BSA und 900 μl Wasser). Es wurden je 900 [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] Bradford-Reagenz in neun Eppis vorgelegt. In die Eppis wurde weiterhin wie aus der Tabelle zu entnehmen ist, hinzupipettiert:
Tab. 1: Schema zur Befüllung der Eppi.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Die Proben wurden durch mehrmaliges Invertieren gemischt und die OD bei 595 nm gemessen.
Für die Analyse der Kinetik des ATP-Abbaus mittels Luciferase-Assays wurden je 50 μl von den verdünnten ATP-Lösungen, die zu Beginn hergestellt wurden in Vertiefungen der Mikrotiterplatte vorgelegt. Auch je 50 μl der fünf Proben des denaturierten Zellysates wurden in Vertiefungen der Mikrotiterplatte vorgelegt. Anschließend wurden zu jeder Probe 50 μl Luciferin/Luciferase-Reagenz hinzupipettiert und die Platte in den Luminometer gelegt.
3 Auswertung
Für die Auswertung wurden die Ergebnisse der anderen Gruppe berücksichtigt und ein Mittelwert berechnet. Der folgenden Tabelle können die Werte entnommen werden:
Tab. 2: Ergebnisse Luciferase-Assay Kinetik der verdünnten ATP-Lösungen
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Anhand der Daten konnte folgender Graph erstellt werden, wobei mit den Durchschnittswerten beider Gruppen gearbeitet wurde.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Graph 1: Luciferase-Assay ATP-Verdünnungsreihe
Für die Auswertung der OD Messung bei 595 nm wurden die Ergebnis- se beider Gruppen erneut gemittelt.
Tab. 3: Ergebnisse der OD bei 595 nm
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Anhand der Daten konnte folgender Graph erstellt werden, wobei mit den Durchschnittswerten beider Gruppen gearbeitet wurde.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Graph 2: OD bei 595 nm - ATP Standardkurve
Zur Berechnung der Konzentration an ATP im Zellysat wird Extinktion bei 595 nm mit einem Wert von 0,504 berücksichtigt. Zunächst wird dieser Wert in die Geradengleichung der Regressionsgeraden (1) für y eingesetzt und nach x aufgelöst, da somit der Wert für BSA [μg] errechnet ist. Dieser Wert wird dann durch das eingesetzte Volumen (2) geteilt, da sich somit die Konzentration ergibt. Es gilt:
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Zur Auswertung der Kinetik des denaturierten Zellysates wurden folgende Ergebnisse genutzt:
Tab. 4: Werte des Luciferase-Assays
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Der markierte Wert wird aus der Betrachtung ausgegrenzt, da es sich hierbei um einen Ausreisser handelt. Zur weiteren Betrachtung müssen die Werte umgerechnet werden. Dazu werden die Werte in die Geradegleichung der Regressionsgeraden aus Graph 1 für y eingesetzt und nach x umgeformt. Es gilt beispielhaft für den Wert 86265 cps (log(86265) = 4,9358):
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Da es sich hierbei um log [ATP] handelt, ergibt sich eine Konzentration von ܿ [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten].
Es gilt weiterhin Formel (2), wodurch folgende Ergebnisse zustande kommen (Spalte 2). Für die Betrachtung des Verhältnisses von [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] müssen die Werte aus der zweiten Spalte durch den zuvor errechneten Wert für die Proteinkonzentration dividiert werden (Ergebnisse in Spalte 3).
Tab 5: Zusammenfassung der Ergebnisse (der Wert bei t =10 wird nicht weiter betrachtet)
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Anhand der Daten konnte folgender Graph erstellt werden.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Graph 3: Verhältnis von ATP zu Proteinmenge aufgetragen gegen die Zeit
4 Diskussion
Der erste Graph der Luciferase-Assay mit der ATP-Verdünnungsreihe weist, wie erwartet, eine sigmoide Kurve auf. Bei dem Versuchsteil wurde ausgenutzt, dass Luciferin durch das Enzym Luciferase unter ATP-Verbrauch oxidiert. Im letzten Schritt der Reaktion wird ein Proton abgespalten und der angeregte Zustand wird in den Grundzustand von Oxyluciferin überführt. Die überschüssige Energie wird dann in Form eines Photons freigesetzt. Durch die hohe Quantenausbeute gilt, dass die emittierte Lichtmenge proportional zur Menge des ATP ist (Messung mittels Luminometer).
Der zweite Graph zeigt das Bradford-Assay. Bei diesem handelt es sich um eine kolorimetrische Methode zur Konzentrationsbestimmung von Protei- nen. Kern des Assays ist, dass die Bindung von Coomassie Brilliant Blue an ein Protein in saurer Lösung die Verschiebung des Absorptionsmaximums des Farbstoffs von 465 nm nach 595 nm verursacht. Daher ist die Absorption bei 595 nm in einem Bradford-Assay ein direktes Maß für die Proteinkonzentration (vgl. Voet/Voet). Wie zu erwarten war, ist die Extinktion stärker, wenn die Menge an BSA zunimmt. Die ermittelten Werte zeigen diesen Trend an. Durch die Standardisierung konnte dann, wie in Kapitel 3 aufgezeigt wurde, die Kon- zentration des Zellysates berechnet werden.
In dem dritten Graphen wird das Verhältnis von ATP zur Proteinmenge im Verhältnis zur Inkubationszeit dargestellt. Klar zu erkennen ist, dass der Quotient aus ATP und Proteinmenge abnimmt, je länger die Probe inkubiert wurde. Durch einen Ausreisser in der Messung mit dem Luminometer, konnte der Wert nach einer zehnminütigen Inkubation nicht berücksichtigt werden.
5 Literaturverzeichnis
Praktikumsskript zum Versuch F14, Bestimmung des ATP-Gehalts von HeLaZellen mittels einer Lumineszenz-Assays, Fakultät für Chemie und Biochemie der Ruhr-Universität Bochum, Lehrstuhl für Biochemie II des Ruhr-Universität Bochum. Zitiert als Skript.
Voet, Donald/ Voet, Judith G./ Pratt, Charlotte W.: Lehrbuch der Biochemie, Weinheim 2010. Zitiert als Voet/Voet.
1 Kochpuffer: 100 mM Tris-HCl pH 7,9; 10 mM EDTA.
2 10x Lysepuffer: 100 mM HEPES-KOH pH 7,9; 15 mM MgCl2; 100 mM KCl.
- Quote paper
- Anita Greinke (Author), 2016, Versuch zur Bestimmung des ATP-Gehalts von HeLa-Zellen mittels einer Lumineszenz-Assays, Munich, GRIN Verlag, https://www.hausarbeiten.de/document/378403
