Visualization and tracking of single fluorescent molecules is a recent development in optical microscopy holding great promise for the study of cell biological processes. However, the detection and characterization of single molecules in three-dimensionally (3D) extended systems such as living cells has yet to be accomplished. By carefully choosing the hardware components of the microscope and a detailed theoretical description of the imaging process, the imaging conditions could be optimized for single molecule tracking experiments inside the cell nucleus. We developed a two-color widefield fluorescence microscope equipped with an Ar-laser and a He-Ne-laser and two CCD cameras. By programming the hardware of the CCDs we achieve a maximum frame repetition rate of 125Hz. In the first step single protein molecules of the green fluorescent protein (GFP) were detected at room-temperature in 3D-solutions with a time resolution of up to 13ms. The 2D localization precision was determined to be ~25nm. From the trajectories, the diffusion coefficients of single GFP molecules were derived and found to agree well with theoretical expectations. Using the recombinant E. coli ß-galactosidase protein P4K, single molecules could be tracked in the nuclei of 3T3-cells at a spatial accuracy of ~30nm and a time resolution of 18ms. These results suggest that proteins can move inside the nucleus over extended distances by diffusion. However, intranuclear protein diffusion is severely restricted, most likely by multiple association-dissociation events and/or impermeable obstacles. In a further step we examined the intranuclear dynamics of the splicing-factor U1-snRNP on a single molecule level. From these results we derived a model for the dynamics of U1-snRNPs. This model substantiates the view that nuclear speckles are not rigid structures but highly dynamic domains characterized by a rapid turnover of U1-snRNPs and other splicing factors.
Inhaltsverzeichnis
- Einleitung
- Hintergrund und Zielsetzung
- Übersicht
- Theoretischer Teil
- Experimenteller Teil
- Kooperationen
- Biologische Grundlagen
- Das „Green-Fluorescent-Protein" (GFP)
- Das Fusionsprotein p4K
- Der Spleißfaktor „UI small nuclear ribonucleoprotein" (UI-snRNP)
- Zum Kern-Zytoplasma-Transport
- Theoretischer Teil
- Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie
- Prinzipieller Aufbau und Bildentstehung
- Punktiibertragungsfunktion eines Weitfeld-Mikroskops
- Auflösung eines Weitfeld-Fluoreszenzmikroskops
- Näherung der PSF durch eine GAUSS-Funktion
- Laterale Intensitätsverteilung bei einer Defokussierung
- Fluoreszenz einzelner Farbstoffmoleküle
- Singulettsättigung
- Triplettsättigung
- Lichtinduziertes Bleichen
- Anzahl der emittierten Photonen
- Fluoreszenz mehrfach-markierter Proteinmoleküle
- Sättigungsintensität und maximale Fluoreszenzrate
- Lichtinduziertes Bleichen
- Anzahl der emittierten Photonen
- Das Signal-Rausch-Verhältnis
- Photonenstatistik
- Umwandlung der Fluoreszenzphotonen in ein digitales Bild
- Definition des SRV
- Das Prinzip der Nano-Lokalisierung in zwei Dimensionen
- Analyse der Trajektorien einzelner Moleküle
- Das mittlere Verschiebungsquadrat
- Die Verteilung der Sprungdistanzen
- Die Diffusionskonstante bei eingeschränkter Diffusion
- Informationen über die Bewegung der Moleküle in axialer Richtung
- Berechnung des axialen Detektionsintervalls
- Zeitliche Änderung der Molekülzahl im Detektionsintervall
- Optimierung der Aufnahmeparameter
- Das SRV in Abhängigkeit von der Belichtungszeit
- Das SRV in Abhängigkeit von der Pixelgröße
- Die Lokalisierungsgenauigkeit in Abhängigkeit von der Abtastrate
- Abbildung zweidimensionaler Diffusionstrajektorien
- Die Signalbreite diffundierender submikroskopischer Objekte
- Das SRV in Abhängigkeit von der Belichtungszeit
- Optimierung des SRV durch Variation der Anregungsintensität
- Optimierung der Lokalisierungsgenauigkeit
- Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie
- Experimenteller Teil
- Das Mikroskop
- Die Auflösung
- Die Detektionseffizienz
- Der Elektronen-Konversionsfaktor
- Das Prinzip des High-Speed-framing (HSF)
- Die experimentelle Lokalisierungsgenauigkeit
- Zur Probenpräparation
- Herstellung einer Probenkammer
- Immobile Proteinmoleküle in zweidimensionalen Proben
- Immobile Proteinmoleküle in dreidimensionalen Proben
- Mobile Proteinmoleküle in dreidimensionalen Proben
- Proteinmoleküle im Zellkern
- Durchführung eines Einfarbenexperiments
- Durchführung eines Zweifarbenexperiments
- Analyse der Bilddaten
- Bestimmung der Einzelmolekültrajektorien
- Überlagerung der beiden Fluoreszenzkanäle
- Simulation von Fluoreszenzbildern und MONTE-CARLO-Simulationen
- Simulation von Fluoreszenzbildern
- Simulation von Teilchentrajektorien
- Das Mikroskop
- Ergebnisse
- Charakterisierung der Proteinfluoreszenz
- Autofluoreszenz intakter und permeabilisierter Zellen
- Die zweidimensionale Abbildung dreidimensionaler Trajektorien
- Bestimmung des minimalen SRVs
- Bestimmung des axialen Detektionsintervalls
- Simulation zur Abbildung dreidimensionaler Trajektorien
- Zur Wahl der Aufnahmeparameter
- Das Objektiv
- Wieviele Photonen werden zur Detektion eines Moleküls benötigt?
- Die Anregungsintensität
- Die Belichtungszeiten
- Welche Diffusionskonstante kann maximal gemessen werden?
- Der Einzelmolekülnachweis
- Abbildung einzelner GFP- und Antikörper-Moleküle in dreidimensionalen Proben
- Nano-Lokalisierung einzelner immobiler GFP-Moleküle in PAA-Gel
- Abbildung einzelner diffundierender GFP- und Antikörper-Moleküle
- Mobilitätsmessungen an einzelnen P4K-Molekülen im Zellkern
- Visualisierung einzelner P4K-Moleküle im Zellkern
- Tracking einzelner P4K-Moleküle im Zellkern
- Analyse der Trajektorien einzelner P4K-Moleküle
- Analyse der Dynamik des Spleißingfaktors UI-snRNP
- Die intranukleäre Verteilung von UI-snRNP
- Visualisierung einzelner UI-snRNP-Partikel im Zellkern
- Bewegung der UI-snRNPs aus dem axialen Detektionsvolumen
- Analyse der Trajektorien einzelner UI-snRNP-Partikel
- Bestimmung der Dissoziationsrate der UI-snRNPs von den Bindungsstellen
- Zusammenfassung und Diskussion
- Theoretischer Teil
- Experimenteller Aufbau
- Abbildung mobiler Moleküle in wäßrigen Lösungen
- Visualisierung einzelner P4K-Moleküle im Zellkern
- Die intranukleäre Dynamik des Spleißfaktors UI-snRNP
- Modell zur Dynamik der Spleißfaktor-Kompartimente
- Einordnung des Modells in bisherige Ergebnisse
- Ausblick
- Verwendete Abkürzungen und Symbole
- Liste wissenschaftlicher Beiträge
- Publikationen
- Konferenzbeiträge und publizierte Abstracts
- Vorträge
- Literaturverzeichnis
- Quote paper
- Thorsten Kues (Author), 2001, Visualisierung einzelner Proteinmoleküle und Analyse ihrer Trajektorien in intakten Zellkernen mittels Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie, Munich, GRIN Verlag, https://www.hausarbeiten.de/document/178967
