Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Fluoreszenzdynamik in ganzen Zellen von Acaryochloris marina
(A.marina) durch Anregung mittels verschiedener gepulster Lichtquellen mit unterschiedlichen
Anregungswellenlängen bei physiologischen und kryostatischen Temperaturen untersucht.
A.marina ist ein erst 1996 entdecktes Cyanobakterium, welches wegen einer bisher einzigartigen
molekularen Zusammensetzung des lichtsammelnden Antennensystems wissenschaftlich sehr
interessant ist. Während höhere Pflanzen und andere Cyanobakterien überwiegend Chlorophyll a und
b als Hauptpigmente des membraninternen Lichtsammelkomplexes (LHC) aufweisen, enthält der LHC
von A.marina fast ausschließlich Chl d. Bei Chl d ist die langwellige Absorptionsbande im Vergleich
zu Chl a und Chl b um mehr als 30 nm rotverschoben. Dies ermöglicht A.marina, den nahen
Infrarotbereich des Sonnenlichtes zur Photosynthese zu nutzen und auf engem Raum symbiontisch mit
anderen Cyanobakterien zusammenzuleben. Auch die membranexterne Phycobiliproteinantenne (PBP
Antenne) von A. marina hat einen anderen Aufbau als in typischen Cyanobakterien.
Aus dem energetisch niedrigeren Anregungszustand des Chl d und der Struktur der LHC- und PBP Antenne
ergeben sich wesentliche Fragen zum Anregungsenergietransfer in A.marina.
Aus der Analyse der Fluoreszenzdynamik bei physiologischen Temperaturen konnte auf die Dynamik
der Exzitonen im Antennensystem rückgeschlossen werden. Dazu wurden die gewonnenen Messdaten
mit Hilfe eines Kompartimentierungsmodells analysiert und iterativ mit den Messdaten abgeglichen.
Dies ermöglichte die quantitative Erfassung der auftretenden Exzitonen- und Elektronentransferzeiten.
Es zeigte sich insbesondere, dass der Transfer vom terminalen Ende der PBP Antenne in die Chl dhaltige
Core-Antenne mit einer Zeitkonstanten von 60 ps abläuft und damit schneller ist, als bei
anderen Cyanobakterien.
Durch eine Simulation konnte gezeigt werden, dass die Zeitkonstante einer schnellen
Fluoreszenzkomponente an der Grenze des Auflösungsvermögens verkürzt wiedergegeben wird.
Eine Abschätzung des räumlichen Abstands zwischen den nächsten Nachbarn der Pigmente der PBP
Antenne und des Chl d-haltigen LHC aus den gemessenen Spektren mit Hilfe der Theorie des Förster-Resonanz-Energie-Transfers (FRET) unter der Annahme gekoppelter Dipole, ergab einen centercenter
Abstand von 3,3 nm
Inhaltsverzeichnis
1. Fachlicher Hintergrund
1.1 Einleitung
1.2 Lichtsammelkomplex und photochemisches Reaktionszentrum höherer Pflanzen
1.3 Evolution und charakteristischer Aufbau von Cyanobakterien, insbesondere Acaryochloris marina (A.marina)
1.4 Struktur und Absorption der Hauptpigmente des A.marina Lichtsammelkomplexes
1.5 Relaxationsprozesse, Fluoreszenz und Anregungsenergietransfer
1.6 Ratengleichungssysteme gekoppelter Fluorophore
1.7 Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)
2. Pikosekunden- Fluoreszenzspektrometer
2.1 Grundlagen des Single-Photon-Counting Messprinzips
2.2 Doppelt korrelierte Einzelphotonendetektion mit Zeit- und Wellenlängenauflösung
2.3 Variation der Anregungswellenlänge und kryostatische Messungen
2.4 Optische Fehlerquellen
2.5 Elektronische Fehlerquellen
3. Datenanalyse
3.1 Decays, Decay associated spectra (DAS) und Instrumental response function
3.2 Methode der Minimierung der Fehlerquadratsumme
3.3 Bestimmung der Anpassungsunsicherheit
3.4 Geeignete Vorgehensweise bei lokalen Anpassungen
3.5 Diskussion des Anpassungsprozesses, Alternativvorschläge
4. Analyse der Anregungszustandsdynamik im Antennensystem von Acaryochloris marina bei Raumtemperatur
4.1 Fluoreszenzdynamik nach Anregung bei 632 nm
4.2 Einfluss von DCMU auf die Fluoreszenzkinetik
4.3 Gaußbandenanalyse der DAS bei 632 nm Anregungswellenlänge
4.4 Fluoreszenzdynamik bei 600 nm Anregung
4.5 Diskussion der Fluoreszenzkomponenten
4.6 Bestimmung der Transferzeiten im PS II Antennensystem
5. Analyse der Anregungszustandsdynamik im Antennensystem von Acaryochloris marina bei kryostatischen Temperaturen
6. Entkopplung der PBP Antenne vom photochemischen Reaktionszentrum bei niedrigen physiologischen Temperaturen
7. Simulationen zum Auflösungsvermögen
8. Abstandsbestimmung über FRET
9. Fazit zur Anregungszustandsdynamik und Struktur des Antennensystems von A.marina
10. Verzeichnis der Abkürzungen und häufigsten Anglizismen
11. Literaturverzeichnis
12. Danksagung
Abstract
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Fluoreszenzdynamik in ganzen Zellen von Acaryochloris marina (A.marina) durch Anregung mittels verschiedener gepulster Lichtquellen mit unterschiedlichen Anregungswellenlängen bei physiologischen und kryostatischen Temperaturen untersucht.
A.marina ist ein erst 1996 entdecktes Cyanobakterium, welches wegen einer bisher einzigartigen molekularen Zusammensetzung des lichtsammelnden Antennensystems wissenschaftlich sehr interessant ist. Während höhere Pflanzen und andere Cyanobakterien überwiegend Chlorophyll a und b als Hauptpigmente des membraninternen Lichtsammelkomplexes (LHC) aufweisen, enthält der LHC von A.marina fast ausschließlich Chl d. Bei Chl d ist die langwellige Absorptionsbande im Vergleich zu Chl a und Chl b um mehr als 30 nm rotverschoben. Dies ermöglicht A.marina, den nahen Infrarotbereich des Sonnenlichtes zur Photosynthese zu nutzen und auf engem Raum symbiontisch mit anderen Cyanobakterien zusammenzuleben. Auch die membranexterne Phycobiliproteinantenne (PBP Antenne) von A. marina hat einen anderen Aufbau als in typischen Cyanobakterien.
Aus dem energetisch niedrigeren Anregungszustand des Chl d und der Struktur der LHC- und PBPAntenne ergeben sich wesentliche Fragen zum Anregungsenergietransfer in A.marina.
Die Messung der zeitaufgelösten Fluoreszenzspektren wurde mit Hilfe der Methode der doppeltkorrelierten Einzelphotonendetektion durchgeführt, wobei zunächst der optische und elektronische Aufbau der Apparatur für die geplanten Untersuchungen optimiert wurde.
Bei Raumtemperatur wurden drei Fluoreszenzbanden aufgelöst und mit Hilfe einer Gaußbandenanalyse der Emission von Phycocyanin (PC) bei 647 nm, Allophycocyanin (APC) bei 665 nm und Chl d bei 725 nm zugeordnet.
Die Abklingkinetik konnte bei 647 nm und 665 nm (PBP Bereich) mit drei Komponenten und bei 725 nm (Chl d Bereich) mit vier Komponenten angepasst werden. Im PBP Bereich dominiert die schnellste Komponente, welche eine Lebensdauer von 70 ps hat. Diese Fluoreszenzkomponente wurde einem Energietransfer von der PBP Antenne zum Chl d zugeordnet, da in der Chl d Fluoreszenz eine entsprechende Anstiegskinetik nachgewiesen werden konnte. Bei längerer Inkubation von A.marina bei Temperaturen um 0°C steigt im PBP Bereich (647 nm und 665 nm) der Anteil der längeren Kinetiken mit Lebensdauern von 500 ps bzw. 1,4 ns und die Chl d Fluoreszenz (725 m) nimmt entsprechend ab. Dies zeigt, dass es bei Temperaturen um 0°C zu einer Entkopplung der PBP von der Chl d Antenne kommt. Diese Entkopplung erwies sich als teilweise reversibel.
Die relative Verteilung der Abklingkinetiken im Chl d Bereich wurde, bezogen auf den Anteil der Fluoreszenz, welcher dem PS II zugeordnet werden kann, zu 10 % Anteil einer 130ps Komponente und 90 % Anteil einer 630 ps Komponente bestimmt. Die Unterscheidung zwischen PS I und PS II Fluoreszenz war durch Untersuchungen mit dem Inhibitor 3-(3',4'-Dichlorphenyl)-1,1 - Dimethylharnstoff (DCMU) möglich.
Bei kryostatischen Temperaturen wurde, in Übereinstimmung mit [Mimuro,99], nach Anregung mit Laserpulsen der Wellenlänge 400 nm, eine sehr langsame Fluoreszenzkomponente von 15 ns beobachtet. Da diese sehr langlebige Fluoreszenz bei vergleichenden Experimenten nach Anregung bei 632 nm jedoch nicht gefunden wurde, kann sie nicht als ein Beweis dafür herangezogen werden, dass der Primärdonor des PS II in A.marina Chl a enthält, wie von Mimuro et al. angenommen wurde.
Aus der Analyse der Fluoreszenzdynamik bei physiologischen Temperaturen konnte auf die Dynamik der Exzitonen im Antennensystem rückgeschlossen werden. Dazu wurden die gewonnenen Messdaten mit Hilfe eines Kompartimentierungsmodells analysiert und iterativ mit den Messdaten abgeglichen. Dies ermöglichte die quantitative Erfassung der auftretenden Exzitonen- und Elektronentransferzeiten. Es zeigte sich insbesondere, dass der Transfer vom terminalen Ende der PBP Antenne in die Chl d- haltige Core-Antenne mit einer Zeitkonstanten von 60 ps abläuft und damit schneller ist, als bei anderen Cyanobakterien.
Durch eine Simulation konnte gezeigt werden, dass die Zeitkonstante einer schnellen Fluoreszenzkomponente an der Grenze des Auflösungsvermögens verkürzt wiedergegeben wird.
Eine Abschätzung des räumlichen Abstands zwischen den nächsten Nachbarn der Pigmente der PBP Antenne und des Chl d-haltigen LHC aus den gemessenen Spektren mit Hilfe der Theorie des Förster- Resonanz-Energie-Transfers (FRET) unter der Annahme gekoppelter Dipole, ergab einen center center Abstand von 3,3 nm [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten]
1. Fachlicher Hintergrund
1.1 Einleitung
Die direkte Sonneneinstrahlung, von welcher wir jährlich etwa 21 5×10 kJ empfangen, besitzt das größte Versorgungspotenzial unter den regenerativen Energiereservoirs. Mit lediglich 0,025 % dieser 11 Energiemenge werden durch die Photosynthese mittels CO - Fixierung jährlich 5×10 Tonnen 2 Biomasse gebildet, wobei die gesamte organische Materie auf der Erde etwa Trockenmasse entspricht [Lawlor,90,S. 14].
Derartige Zahlen machen die ungeheure Bedeutung der Photosynthese deutlich und dies wird auch durch die Auszeichnung von Michel, Huber und Deisenhofer mit dem Nobelpreis für Chemie, 1988, für die Strukturaufklärung des Reaktionszentrums photosynthetischer Bakterien, gewürdigt.
Die immer noch fehlende effiziente Nutzung der Sonnenenergie durch Solarzellen gibt der Notwendigkeit weiterer Forschung neuen Auftrieb. Photosynthetische Solarzellen sind nach heutigem Stand bereits zur Wasserstoff- und Methangewinnung tauglich. Die Analyse der Photosyntheseaktivität liefert Informationen, welche für ein tieferes Verständnis der Pflanzenphysiologie notwendig sind.
Für das Verständnis der an der Photosynthese beteiligten Prozesse ist auch die Dynamik der Anregungszustände nach Lichtabsorption relevant (analog zu den Elektron-Loch Paaren in Halbleitern kann man hier von Exzitonen sprechen).
Neben der Röntgenstrukturanalyse, dem Tracing von Radionukliden, der Gaswechselanalyse und der zeitaufgelösten Absorptionsspektroskopie liefert die Fluoreszenzdynamik von photosynthetischen Organismen wichtige Informationen, speziell über den Transfer der Anregungsenergie im Antennensystem zum Reaktionszentrum (RC), wo es zur Ladungstrennung kommt. Antennensysteme sind Pigment-Protein-Komplexe (PPC), welche das Sonnenlicht für die Photosynthese absorbieren. Dabei wurde das Cyanobakterium Acaryochloris marina (A.marina) als Gegenstand der Untersuchung ausgewählt, da es nach seiner Entdeckung 1996 [Miyashita,96] bis heute der einzig bekannte photosynthetische Organismus ist, dessen Antennensystem überwiegend aus Chlorophyll d (Chl d) besteht. Alle höheren Pflanzen und Cyanobakterien verwenden Chl a und Chl b als Antennenpigmente. Das Absorptionsspektrum von Chl d ist im langwelligen Bereich rotverschoben zu Chl a und Chl b. Dies wirft Fragestellungen bezüglich der grundlegenden Transportmechanismen von Exzitonen in der Antenne von A.marina auf.
Die Lichtabsorption durch PPC in den Antennensystemen autotropher Organismen ist der erste photosynthetische Schritt, an welchen sich dann durch Singulett-Singulett Energietransfer auf einer +· Zeitskala von Pikosekunden die Bildung eines primären Radikalionenpaares P 680 Pheo -· im Reaktionszentrum des Photosystems II anschließt [Holzwarth,89]. Die Pigmente der Antenne erhöhen den Absorptionsquerschnitt für Lichtquanten, aber übernehmen auch regulatorische Aufgaben bei der Anpassung an unterschiedliche Lichtbedingungen.
Die Untersuchung des Zusammenspiels verschiedener Pigmente beim Transport der Exzitonen durch eine Analyse der Dynamik des Fluoreszenzlichtes nach Anregung mit verschiedenen Wellenlängen und bei unterschiedlichen Temperaturen bildet den Inhalt dieser Arbeit.
1.2 Lichtsammelkomplex und photochemisches Reaktionszentrum höherer Pflanzen
In den hochspezialisierten Pigment-Protein-Komplexen (PPC) [Häder,99] aller photosynthetischen Organismen laufen die wesentlichen Schritte der Photosynthese ab. Dies sind Bildung und Transport von Anregungszuständen nach Lichtabsorption, bis diese durch das Reaktionszentrum (RC) eingefangen werden. Daran schließt sich der Transport von Elektronen und damit die Erzeugung von elektrischem Membranpotenzial und Protonengradienten an. Schließlich werden Nicotinamid-Adenin- Dinucleotidphosphat (NADPH) und Adenosintriphosphat (ATP) als Reduktions- bzw. Energie- äquivalent gebildet, was im Wesentlichen durch die erzeugten elektrischen Potenziale getrieben wird.
Die PPC befinden sich im Bereich der sogenannten Thylakoidmembran, entweder innerhalb dieser Membran (membranintern) oder außerhalb an diese angelagert (membranextern). Die Thylakoidmembran trennt das Thylakoidlumen vom Zell- oder Chloroplastenstroma. Die Thylakoide selbst sind in gestapelter (als Granathylakoide) oder nicht gestapelter Form (als Stromathylakoide) in allen photosynthetischen Zellen enthalten. Bei Eukaryonten, deren Zellen einen Zellkern besitzen, sind die Thylakoide meist in den Chloroplasten lokalisiert. Das in dieser Arbeit untersuchte Cyanobakterium Acaryochloris marina (A.marina) besitzt dagegen keine Chloroplasten und keinen Zellkern und ist demnach per Definition ein Prokaryont.
Bei der Analyse der Membran hatte sich gezeigt, dass eine funktionelle Unterteilung des Photosyntheseapparates zu sogenannten Kompartimenten realisiert ist. Dies sind abgegrenzte Teilbereiche mit einem Molekulargewicht von 4 bis über 50 kDa (4 - 50 kg/mol) , welche sich durch charakteristische Eigenschaften und Aufgaben auszeichnen. So ist eine grobe Unterteilung gegeben durch die Unterscheidung zwischen den Lichtsammelkomplexen (LHC), in welchen Anregungszustände (Exzitonen) transferiert werden, und den Reaktionszentren (RC), in denen die Ladungstrennung stattfindet. Ein gerichteter Elektronentransport von Wasser zu NADP+ wird von zwei RC getrieben, die jeweils in einem Photosystem (PS) lokalisiert sind. Dies findet mit Hilfe der im zugehörigen LHC absorbierten Lichtenergie statt. Historisch bedingt bezeichnet man dabei das System, dessen wesentliche Aufgabe in der Oxidation von Wasser [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] und dem 2 Elektronentransport bis zur Reduktion von Plastochinon [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] besteht, als das Photosystem A B II (PS II). An dieses schließt sich das PS I an, im Rahmen dieser Arbeit wurde jedoch lediglich das PS II untersucht [Häder,99],[Lawlor,90].
Seit der Aufklärung von Struktur, Lage und Orientierung des LHC sind viele Details des Anregungsgenergietransports geklärt worden. Offene Fragen bestehen vor allem bezüglich des genauen Zusammenspiels der einzelnen Untereinheiten. Insbesondere bei A.marina, dessen PS II aufgrund der einzigartigen Zusammensetzung aus einer membranexternen Antenne aus Phycobiliproteinen (PBP) und einer im wesentlichen Chl d-haltigen membraninternen Antenne noch kontrovers hinsichtlich der Exzitonentransportmechanismen sowie insbesondere der Struktur des RC II diskutiert wird. Der Aufbau des PS II soll jedoch zunächst am Beispiel höherer Pflanzen und eukaryontischer Algen dargestellt werden.
Wie Abb. 1.1 [Barber,97] zeigt, besteht das PS II aus zahlreichen Untereinheiten, welche sich wiederum zu größeren Gruppen zusammenfassen lassen. Die als LHCb 1-6 bezeichneten Komplexe gehören zur „peripheren“ Antenne. Ihre Aufgabe besteht im Wesentlichen darin, den Absorptionsquerschnitt für Photonen zu erhöhen. Struktur und Zusammensetzung dieser Systeme ist von Organismus zu Organismus sehr unterschiedlich.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Bei höheren Pflanzen besteht der LHC aus Proteinen und Pigmenten wie Chl a und Chl b sowie aus Carotinoiden [Bergmann,99]. An diese schließen sich Komplexe an, welche überwiegend aus Protein und kaum aus Pigmenten bestehen (in Abb. 1.1 schwarz gezeichnet). Sie gehören zum sogenannten „Core complex“ des PS II. Ihre Aufgabe besteht in der strukturellen Stabilisierung und sie funktionieren auch, wie der Proteinkomplex S, als „Linkerproteine“, welche die räumliche Anordnung der Pigmente stabilisieren. Oft ist ihre genaue Funktion heute noch unklar [Barber,97],[Barber,03].
Während der Evolution fast unverändert blieben dagegen die Komplexe CP43 und CP47 (Core- Proteine), welche die „Core-Antenne“ bilden. Sie beinhalten an Pigmenten Chl a Moleküle und Carotinoide. Das RC bilden die Komplexe D1 (Donorseite) und D2 (Akzeptorseite). Wie in Abb. 1.1 zu erkennen, wird über einen funktionell im Detail noch ungeklärten Mechanismus durch einen Komplex aus 4 Manganionen der energetische Zustand der Elektronen im [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] angehoben. Dies aktiviert die Abgabe von 2 Elektronen pro Molekül [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] an einen Zwischenakzeptor [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten], welcher als primärer Elektronendonor an P 680 fungiert.
P 680 ist dabei eines von zwei Chl a- Molekülen, welche das sogenannte „Special-Pair“ bilden. Dieses bildet eine flache energetische Senke für die Exzitonen des LHC [Eckert,87]. Über eine Wechselwirkung mit Pheophetin (Pheo), den primären Elektronenakzeptor, wird die Oxidation des P 680 ermöglicht, welches ein Elektron an das Plastochinon [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] abgibt (Chem 1.1). [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] befindet sich in D2 und von dort wandert das Elektron mit Hilfe von Eisen im Plastochinonpool weiter zum [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] um sich über den Cytochromkomplex in Richtung PSI zu bewegen:
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Chem1.1 : Wichtigste Schritte der Ladungstrennung nach Einfangen des Anregungszustandes im RC, welches in WW mit den Antennenchlorophyllen steht. Abgabe eines Elektrons an Pheophetin (Pheo) und Plastochinon (Q A).
1.3 Evolution und charakteristischer Aufbau von Cyanobakterien, insbesondere Acaryochloris marina (A.marina)
Cyanobaterien, sogenannte „Blaualgen“, sind Prokaryonten, wie die meisten einzelligen Lebewesen. Das bedeutet, ihre Zelle besitzt keinen Zellkern. Das genetische Material ist also nicht von einer Membran eingeschlossen.
Die ersten Prokaryonten [Hoffmann,75, S. 223 ff.] entwickelten sich im sogenannten „Alt- Präkambrium“ vor etwa 3-4 Mrd. Jahren. In einer reduzierenden Atmosphäre schufen Sie die Bedingungen für die Entwicklung der Aerobier. Die Cyanobakterien oder Blaualgen leiten sich heute aus diesen ersten prokaryontischen Photosynthetikern ab. Sie bildeten sich im Mittel-Präkambrium vor etwa 2 Mrd. Jahren [Lawlor,90, S. 18 ff.] und gelten als die ersten photosynthetischen Organismen, „[...] die zwei Photosysteme über eine Elektronentransportkette zu einem leistungsfähigen Tandem kombinierten und den wasserspaltenden Apparat als Elektronendonor am Photosystem II entwickelten.“ [Häder,99, S. 63]. Sie schließen die Lücke zwischen den ersten photosynthetischen Bakterien und den nachfolgenden eukaryontischen Algen und schließlich höheren Pflanzen (Jungpräkambrium vor ca. 1 Mrd. Jahre).
Einher mit der Evolution von Prokaryonten zu Eukaryonten geht die Evolution der Plastidenstruktur von primitiven Photosynthetikern zu Chloro- plasten [Häder,99, S. 48]. Zur Vergrößerung der photosyn- thetisch aktiven Fläche bildeten sich intracytoplasmatische Membranen (Invaginationen) (Abb. 1.2 a) , welche sich bei den Cyanobakterien (Abb. 1.2 b) von der Cytoplasmamembran ablösten und eigenständige Thylakoide bildeten. Der Protonengradient zwischen dem Cytoplasma (Stroma) und dem Thyakoidlumen im Inneren der Thylakoide treibt die ATP Synthese an.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Nach der heute allgemein akzeptierten Endosymbiontentheorie bildeten sich die eukaryontischen Zellen durch Phagocytose der Prokaryonten, also durch Aufnahme dieser in die eigene Zelle. Insbesondere die Existenz eigenständiger DNS in den Chloroplasten (Abb. 1.2 c) (wie auch in den Mitochondrien) untermauert diese Theorie. Mit dem Beginn dieser symbiontischen Prozesse bildeten sich wohl auch die Granastapel der Thylakoide, wie sie typischerweise in den Chloroplasten vorgefunden werden.
Charakteristisch für die heutigen Cyanobakterien im Gegensatz zu Grünalgen ist das Vorkommen der Biliproteine Allophycocyanin (APC), Phycocyanin (PC) und Phycoerythrin (PE) (Phycobiliproteine) als Photosynthesepigmente, sowie eine dimere Struktur des PS II [Häder,99, S. 63]. Als Chlorophyllpigment findet sich meist Chl a. (Synechocystis, Synechococcus, Cyanidium caldarium, Spirulena platensis) [Li,01], [Stec,99], [Mullineaux,91].
Eine andere Gruppe Cyanobakterien, die sogenannten Prochlorophyten, besitzen keine Phycobiliproteine (PBP), jedoch sogenannte „Pcb Proteine“, welche Chlorophylle binden können. Meist überwiegt Chl a (Prochloron) [Bibby,03]. Der Großteil der Cyanobakterien gehört jedoch nicht zu den Prochlorophyten und unterscheidet sich von höheren Pflanzen vor allem durch die PBP, während der LHC höherer Pflanzen ausschließlich aus den Pigmenten Chl a und Chl b gebildet wird.
Eine Besonderheit stellt A.marina dar, in dessen Antennensystem sich neben Phycocyanin (PC) und Allophycocyanin (APC) überwiegend Chl d findet, das in einem membraninternen Pcb Komplex lokalisiert ist.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Diese Aspekte weisen darauf hin, dass die Untereinheiten des LHC II bei Cyanobakterien von anderer Form als bei höheren Pflanzen sind und bei A.marina wiederum eine eigene Struktur besitzen. Die Biliproteine der Cyanobakterien sind meist in Phycobilisomen organisiert. Diese werden üblicherweise dem PS II zugeordnet, sind jedoch auf der Membran beweglich und nur schwach gebunden [Stec,99], [Mullineaux,97]. Phycobilisome bestehen aus tonnenförmig gestapelten, hexameren Strukturen. Die Hexamere bestehen aus je zwei Trimeren aus Phycocyanobilin, das ist an Proteine gebundenes Phycocyanin (vgl. Abb. 1.8). Am Fußpunkt schließen sich Stapel sogenannter „Heterohexamere“ mit den Pigmenten PC und APC oder APC Hexamere an [Holzwarth,91], [Hu,99]. Der Durchmesser dieser Strukturen liegt bei 11 nm, also etwa so groß wie die Dicke der Membran. Die Länge der Stapel variiert mit der Anzahl der Hexamere (6 nm pro Hexamer) [Stec 99].
Dieses gesamte Antennensystem ist mit dem membraninternen LHC assoziiert (vgl. Abb. 1.3).
Acaryochloris marina teilt sich im Great Barrier Reef (dt. Großes Barriere-Riff) vor der Küste Australiens mit Prochloron didemni eine Ascidie als Symbionten. Dabei spielen die optischen Eigenschaften jedes der drei Organismen eine wichtige Rolle. Während die heterotrophe Ascidie UV- Strahlung absorbiert und dadurch die empfindlichen photosynthetischen Systeme der Cyanobakterien geschützt werden, nutzt Prochloron mit Chl a Antennen vornehmlich das Licht im Wellenlängenbereich um 674 nm [Bibby,03]. Das Chl d von A.marina absorbiert dagegen vor allem Licht zwischen 700 nm und 730 nm. Das zur Verfügung stehende Licht unterhalb von 650 nm, welches von Prochloron ebenfalls nur schwach absorbiert wird, kann die Phycobiliproteine von A.marina anregen. Somit wird das elektromagnetische Spektrum zwischen 600 und 730 nm durch diese Symbiose optimal ausgenutzt .
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
In elektronenmikroskopischen Aufnahmen (Abb. 1.4) sind die Thylakoide (Th) der prokaryontischen und damit ansonsten fast strukturlosen Zelle gut zu erkennen. Die elliptischen Zellen haben eine Größe von ca. 2 x 1,6 µm [Marquardt,00].
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Zwar werden die für Cyanobakterien typischen Strukturen des PS II auch bei A.marina gefunden, doch sind diese anders organisiert. Je nach Lichtverhältnissen bei der Anzucht finden sich in den Zellen 20 - 100 mal mehr Chl d als Chl a [Mimuro,04], sowie Spuren von Chl c, Zeaxanthin und Alpha- Carotin [Miyashita,97]. Daneben weisen die Zellbestandteile ebenfalls PC und APC mit einem wesentlich höheren Anteil PC auf [Marquardt,97], [Hu,99]. Sie sind jedoch nicht als Phycobilisome angeordnet sondern als „stangenförmige Strukturen“ (engl. „Rods“) [Marquardt,97], welche sich auf der cytoplasmatischen Seite des PS II befinden [Hu,99]. Es fehlen die tonnenförmigen Strukturen aus APC, die sogenannten „Cores“ der Phycobilisome. Statt dessen weisen die Molekulargewichte der gefundenen Fragmente und der Anteil an APC darauf hin, dass der Rod aus Hexameren von PC in einem Heterohexamer aus PC und APC endet, welches über ein Linker-Protein in direktem Kontakt mit dem Superkomplex des PS II steht (Abb. 1.5) [Marquardt,97], [Hu,99]. Direkt an A.marina wurde gezeigt, dass der Rod etwa 50 Pigmentmoleküle beinhaltet [Marquardt,97].
Marquardt et al nehmen dabei eine Aggregation von PC und APC zu Trimeren [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] aus sogenannten (ab) Monomeren an, wie sie 1986 von Schirmer mit 25 nm Auflösung beschrieben wurde [Schirmer,86]. PC ist ein (ab) Monomer aus 3 Phycocyanobilinen als Chromophore, APC ein entsprechendes Monomer, welches jedoch aus nur 2 Phycocyanobilinen besteht. Jeweils zwei ([Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] Trimere wiederum bilden ein Hexamer. Zwischen den Pigmenten in diesen Scheibenstrukturen gibt es theoretisch optimale Orientierungen, bei deren Realisierung eine spiralförmige Wanderung des Anregungszustandes vom PC zum APC stattfindet [Stec,99]. Die Zeitkonstante für einen Übergang zwischen den PC-Molekülen verschiedener Scheiben in Richtung Reaktionszentrum wird mit 3-10 ps angegeben [Holzwarth,87]. Andere Gruppen sprechen von mindestens 5 ps [Stec,99]. Die nachfolgenden Schritte sind dagegen wesentlich langsamer.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Inzwischen liegt eine neue Arbeit von Chen et al. [Chen,05] vor, welche die Struktur des Core complex von A.marina zeigt (Abb. 1.6). Demnach besteht dieser aus einem Superkomplex mit 2 RC II - Dimeren und flankierenden D1/D2 Proteinen sowie 16 Pcb Proteinen. Jedes RC II Dimer mit Core Antenne beinhaltet 72 und jedes Pcb 14 Chl d Moleküle. Das Molekulargewicht der Pcb liegt bei 35 kDa und das der RC II Dimere mit Antenne und assoziierten Proteinen ohne Pcb bei 850 kDa, so dass sich für diesen Komplex bei Dimensionen von 38,5 x 24 nm ein Molekulargewicht von etwa 2300 kDa ergibt und eine Summe von 368 Chl d Molekülen, also 92 Chlorophylle pro Reaktionszentrum.
Da sich bei A.marina ein schnellerer Energietransfer zwischen Rod und dem Superkomplex zeigt als bei Cyanobakterien mit Phycobilisomen (z.B. Synechococcus, [Mullineaux,91]), ist es umstritten, ob A.marina ein Vorläufer der phycobilisomhaltigen Blaualgen ist oder sogar eine evolutionäre Weiterentwicklung zur Reduktion der Phycobilisome führte. [Hu,99]
1.4 Struktur und Absorption der Hauptpigmente des A.marina Lichtsammelkomplexes
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Das bekannteste Pigment der Photosynthese, welches sich auch in allen grünen Pflanzen und Cyanobakterien findet, ist das Chlorophyll. Das Chlorophyll kann als Chlorophyll a, b, c oder d auftreten (Abb. 1.7). Grundsätzlicher Aufbau ist ein Porphyrinringsystem aus 4 Pyrolringen, in dessen Mitte ein Magnesiumatom über 2 kovalente und Stickstoff gebunden ist. Die verschiedenen Chlorophylle unter- scheiden sich lediglich durch eine unterschiedliche funktionelle Gruppe.
Pheophetin, der primäre Elektronen- akzeptor des PSII, besteht im Wesentlichen auch aus einem Porphyrinringsystem, allerdings ohne das zentrale Magnesiumatom, sondern mit einer H - Gruppe. Phycocyanobilin (Abb. 1.8) besteht ebenfalls aus 4 Pyrolringen, die jedoch in Biliproteinen an helicicale Aminosäurestrukturen gebunden sind und dabei kein Porphyrinringsystem bilden (sie sind oxidativ geöffnet). Wesentlich ist, dass das System von Pyrolringen mit einigen der angrenzenden Gruppen ein großräumiges System konjugierter Doppelbindungen darstellt, welches eine Delokalisation der Elektronenaufenthalts- wahrscheinlichkeit über das gesamte Molekül bewirkt. Systeme konjugierter Doppelbindungen sind leicht anzuregen (Niveauunterschied der Singulettzustände meist ~2 eV) und bilden die Gruppe der sogenannten „Farbstoffe“, da ihre Absorptionslinien im optischen Bereich liegen.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Das Termschema des Chl d in 40:1 Methanol:acetonitril bei 170 K (Abb. 1.9 a) wurde nach [Nieuwenburg,03] konstruiert. Aus den dort genannten Halbwertsbreiten konnte mit Hilfe der Extinktion im Maximum bei 699 nm [Sivakumar,03] ein quantitatives Absorptionsschema des Chl d
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
(Abb. 1.9 b)) bestimmt werden, welches für die späteren Berechnungen zum Förster Transport von Relevanz ist.
Das Vibrations- und Rotationsspektrum von Chlorophyll ist äußerst kompliziert. So treten die charakteristischen Vibrationsniveaus n x von Por- phyrinringsystemen auf, welche im Wesentlichen Schwingungsmoden der Doppelbindungen wie C= O oder der Einfachbindungen wie N-H entsprechen. Longitudinale Schwingungen von C= O liegen beispielsweise bei 1230-1300/cm und 1600-1690 /cm [Harris,94].
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Feinere, niederfrequentere Schwingungszustände n ´ ergeben x sich durch die Bewegung des Magnesiumatoms [Renger,T.,01, S. 147 f.] oder Torsionen von C - N [Harris,94] mit Frequenzen von 200 - 350 /cm. In A.marina ist durch den Einfluss der Mikroumgebung die Hauptabsorptionsbande Q (0,0) des Chl d nach 714 nm y [Miyashita, 97] bzw. gemäß einer eigenen Messung (Abb. 1.10) nach 717 nm verschoben.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Das Absorptionsspektrum von Phycocyanin (PC) und Allophycoyanin (APC) gemäß [Hu,99] zeigt Abb. 1.11.
1.5 Relaxationsprozesse , Fluoreszenz und Anregungsenergietransfer
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Anregungszustände können über verschiedene Abbaukanäle relaxieren (Abb. 1.12). Diese werden in einem sogenannten Jablonski-Diagramm, welches das Termschema des entsprechenden Moleküls beinhaltet, dargestellt.
Die Absorption erfolgt instantan, jedoch nicht in den Schwingungsgrundzustand der angeregten Singulettzustände, sondern in ein höheres Schwingungsniveau. Hierbei wird im Allgemeinen nicht die hochfrequente Schwingungsmode [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] angeregt, sondern ein Schwingungsniveau [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten]. Die Anregung in höhere Schwingungszustände wird dadurch bedingt, dass die Wellenfunktion aus dem Grundzustand nach dem Franck-Condon Prinzip mit der höchsten Wahrscheinlichkeit in einen bezüglich der Schwingungszustände symmetrischen Anregungszustand übergeht, welcher nicht der [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] ´ Zustand ist. Man kann sich dies derart vorstellen, dass bei Anregung durch die Trägheit des 0 0 nuklearen Gerüstes die Molekülgeometrie erhalten bleibt, was aufgrund des veränderten elektrischen Feldes einem höheren Anregungszustand als [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] gleichgesetzt werden kann [Häder,99, S. 78 f.].
Mit Raten [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] fallen die Elektronen aus [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] in den Zustand Wegen des Franck-Condon Prinzips fällt ein Fluoreszenzphoton anschließend aus dem Zustand [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] wiederum in einen angeregten Vibrationszustand [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten]. Das Fluoreszenzmaximum ist somit gegen das Absorptionsmaximum rotverschoben. Dieser Effekt wird als Stokes shift bezeichnet.
PC und APC zeigen aufgrund der molekularen offenen Struktur beim Raumtemperatur in Lösung einen Stokes shift von etwa 20-30 nm, während diese Verschiebung bei den starren Chlorophyllmolekülen nur etwa 8 nm beträgt (gemessene Verschiebung des Hauptfluoreszenzpeaks im Vergleich zur [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] Bande).
Aufgrund des geringen energetischen Abstandes zwischen den Singulettzuständen [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] verläuft auch der Übergang aus[Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] . (Die Übergangsraten [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] Aus Abb. 1.12 sind für jeden Zustandswechsel unterschiedlich!), so dass Fluoreszenz ([Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] überwiegend im Bereich [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] nm, nämlich von Elektronen, beobachtet wird. Aus dem S ist die interne Konversion [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten], was auf die energetische Distanz zum Grundszustand und die starre Struktur des Porphyrinringsystems zurückgeführt werden kann, viel langsamer.
Der Grundzustand des Chlorophylls ist von 2 Elektronen besetzt. Durch die interne LS- Kopplung (Wechselwirkung des Spins mit dem elektronischen Bahnmoment) sollte ein Spinflip beim Übergang in [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten]eigentlich unwahrscheinlich sein. Aufgrund von intramolekularen Störpotenzialen läuft dieses „Inter System Crossing (ISC)“ für Chlorophyll mit [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten]trotzdem sehr häufig ab, und nach Spinflip befindet sich das Chlorophyllmolekül im angeregten Triplettzustand [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten]. Nach dem Pauliprinzip ist für die Spontanemission ein erneuter Spinflip erforderlich, so dass der T Zustand sehr langlebig ist. Radiativer Abbau mit [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] wird hier als Phosphoreszenz und nicht als Fluoreszenz bezeichnet [Heath,72 S. 28]. Dies ist für photosynthetische Organismen von Nachteil, da durch Reaktion mit Sauerstoff, dessen Grundzustand ein Triplettzustand ist, mit [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] reaktiver Singulettsauerstoff gebildet werden kann, welcher dann bedeutende Zellstrukturen oxidiert.
Daneben kann der Zustand S mit [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten], der sogenannten Singulett-Singulett Annihilation abgebaut werden, ein Prozess, der jedoch von der Konzentration besetzter[Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] Zustände in der Probe abhängt.
Trotz der Konkurrenz des Anregungsenergietransfers besitzen in aktiven photosynthetischen Organismen Fluoreszenz und ISC üblicherweise einen Anteil von einigen Prozent. Die Triplettzustände des Chlorophylls werden vor allem durch Reaktion mit Carotinoiden im Singulettzustand gelöscht [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten]. Carotinoide sind sehr beweglich und bilden sogenannte dissipative Senken für die Triplettzustände, da sich ihre Anregungszustände mit hoher Effizienz über interne Konversion (Wärme) abbauen.
Effiziente Photosynthese findet ausschließlich über den Transfer der Anregungszustände aus den Antennenpigmenten zum Reaktionszentrum statt. Wirksam ist sie deshalb nur mit [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] hohe Transfereffizienzen von etwa 98 % zu erreichen. Dieser Prozess bestimmt die Dynamik der Anregungszustände und damit die Fluoreszenzkinetik.
Der Abbau der Besetzung [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] eines Anregungszustandes [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] erfolgt mit der Summe aller beteiligten Zerfallsraten (vgl. Abb. 1.12):
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Dies kann über die Zeit integriert werden und es folgt für den Abbau der Zustandsbesetzung
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
[...]
- Quote paper
- Franz-Josef Schmitt (Author), 2005, Untersuchung der Fluoreszenzdynamik im Antennensystem des Chlorophyll d-haltigen Cyanobakteriums Acaryochloris marina, Munich, GRIN Verlag, https://www.hausarbeiten.de/document/159773
